酵母新絮凝特性的研究进展及应用展望‘刘楠，王冬立，何秀萍，张博润(中国科学院微生物研究所，北京，100080)摘要酵母絮凝是指酵母细胞之间相互作用形成絮状物的可逆过程。在发酵工业中，絮凝是酵母菌株最重要性质之一。酵母无性絮凝分为Flo型和NewFlo型，在发酵后期表达的NewFlo型絮凝对细胞与发酵液的分离及产品的质量有重要的意义。文中对酵母新絮凝的研究进展进行了综述，并展望了新絮凝特性在工业中的应用前景。关键词酵母，新絮凝特性，遗传学，生理生化性质酵母细胞凝聚有3种形式：(1)链形成凝聚：在酵母细胞繁殖过程中，芽细胞未能从母细胞脱落，不断进行细胞繁殖之后形成细胞链。(2)交配凝聚：由不同交配型细胞交换交配信息之后，通过表面特殊的蛋白与蛋白连接引起细胞凝聚。(3)无性絮凝：由细胞表面蛋白和酵母细胞外壁的甘露糖结合所引起的细胞凝聚，即真正的絮凝。根据糖抑制作用，将酵母絮凝表型分为Flo型和NewFlo型L1+(图1)。酵母的絮凝作用链形成凝聚无性絮凝交配凝集厂—十——……7 no型絮凝NewFlo型絮凝(甘露糖专一抑制)(葡萄糖及甘露糖等抑制)图1酵母凝聚的分类Flo型絮凝为组成型表达，在发酵各个时期均可表达。而NewFlo型为诱导型表达，只有在发酵液中糖浓度小于0．3％时才絮凝[引。在工业发酵中，通常希望在发酵结束时，分散于发酵液中的酵母细胞相互凝聚形成絮凝颗粒沉积，从而有利于细胞同发酵液的有效分离，大大简化后处理工艺，降低成本。F1。型絮凝过早会造成发酵迟缓，延长发酵时间，同时会影响产品质量。能在发酵后期表现出强大絮凝能力的酵母菌株是实际生产应用中迫切需要的。NewFlo型酵母细胞在发酵糖类消耗完全之前产生絮凝正是发酵工业所需要的，对细胞与发酵液的分离及产品的质量有重要的意义。目前对酵母新絮凝的遗传学研究及生理生化性质研究已经取得重要进展，本文对该领域的研究进展和应用前景做一简要综述。第一作者：博士，助理研究员。，国家科学自然基金资助项目(No．30370025)收稿日期：2006—11—151酵母新絮凝的遗传学研究当絮凝基因被激活后，絮凝素开始表达，絮凝作用发生。絮凝基因种类很多。可以表达产生絮凝是由酵母细胞壁上的特定蛋白与其他酵母细胞的甘露糖残基之间的专一性结合引起的。这种特定蛋白称为“絮凝素”。编码酵母絮凝素的基因称为絮凝基因(FLO基因)13i。Flol型絮凝的基因称为絮凝基因，而赋予酵母菌株NewFlo型的基因称为新絮凝基因。Osamu等人采用反向PCR的方法从底层发酵酵母菌株SaccharomycescerevisiaeKBY001中克隆大约9kb的DNA片段，转化／Y01破坏菌株KY644，使该菌株产生了絮凝。对该菌株絮凝表型的生理生化性质检测表明，该絮凝表型不仅能被甘露糖抑制，同时还能被葡萄糖和麦芽糖抑制，是典型的NewFl。絮凝表型。该DNA片段被命名为Lg-FL01。对Lg-FL01序列分析结果表明，其5’端的694bp与FL01有61．7％的同源性，而3’端的2903bp与FL01有55．1％的同源性。作者推测该基因的开放阅读框为5．8kb，但目前还没有该基因完整序列的报道。Osamu等人对Lg-F101蛋白N末端进行了分析，发现特定区域的氨基酸的变化赋予了转化子新絮凝表型。当209—240区域氨基酸被置换后，导致转化菌株失去了絮凝表型，当202位置上的脯氨酸被替换成苏氨酸后，该基因序列又重新赋予菌株NewFlo絮凝表型。这个结果说明，Lg-Flolp202位置的脯氨酸和209—240区域的氨基酸是酵母NewFlo絮凝表型所必需的。其中，209—240区域是甘露糖识别位点，但不是葡萄糖识别位点，当209—240区域氨基酸发生改变，不能被甘露糖识别时，202位置上的苏型趔f89FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES氨酸可以同时和甘露糖和葡萄糖相互作用。另外，当226-236区域氨基酸为VSLGT-T时，转化子为Flo絮凝表型，而为VSWGT-A时，转化子表现为介于NewFlo和Flo之间的絮凝表型，当为GALGTT时，转化子则表现为NewFlo絮凝表型。Osamu等人的研究结果表明，Lg-F101p和FlolpN末端个别氨基酸的差异引起了酵母菌株絮凝类型的不同l：㈠i。作者所在实验室在国家自然科学基金的支持下，近年来一直致力于酵母絮凝的研究，先后进行了絮凝基因的克隆和在工业用酵母菌中的表达研究，获得絮凝性强及熟化期短的啤酒酵母工程菌16”j。从强絮凝酿酒酵母菌株S．cerevisiaeYN79克隆得到了可以赋予非絮凝菌株YS58新絮凝表型的5．3kb的DNA别区域FLON6与Lg-FL01相同，推测FLON6为新絮凝基因。FLON6与FL01相比同源性为94％，其差异碱基集中在一个特定区域内。这些差异性的核苷酸都是来源于FL01内部的重复序列，说明该基因是由FL01内部重复序列重排产生的。FLON6的5’端部分序列已提交到GenBank中(No．EFl06975)。有关FLON6基因的遗传调控、结构与功能及其在工业酵母菌株中的表达研究正在进行中。2新絮凝的生理生化性质研究Flo型和NewFlo型絮凝在生理生化性质方面有明显的差异。作者所在实验室对5株分别属于NewFlo型和Flo型酵母菌株的絮凝表型的生理生化片段，命名为FLON6。序列测定和分析结果表明性质进行了研究，结果表明NewFlo型絮凝对各种外FLON6与Lg-FL01有95％的同源性。在甘露糖识界条件的变化均较Flo型敏感[o，lo](表1)。表1外界条件对酵母FIo型及NewF!o型絮凝的影响温度和pH值一向被认为是影响酵母絮凝的重要因素。研究结果表明，新絮凝一般出现在pHI．5—9的范围内，但是在pH3．5—5．8时，絮凝效果最好。NewFlo型酵母菌株对低pH的敏感程度要大大高于Flo型，当pH<2时，NewFlo型酵母会很快失去絮凝表型，而Flo型酵母细胞絮凝能力则变化不大。当培养温度>60℃时，絮凝细胞会分散，此现象被称为“絮凝熔融”。高温(>60C)抑制NewFlo型絮凝的程度要比Flo型大的多。Flo型和NewFlo型菌株的絮凝都依赖于C-2+。最适C／+浓度为10 mmol／L一1．0 mol／I．，NewFlo型菌株对Ca2+浓度变化较Flo型菌敏感，当Ca2+浓度低于10mmol／L或高于2．0mol／L时即表现出较明显的絮凝抑制。NewFlo型菌株对蛋白酶k、蛋白酶E、胰蛋白酶相当敏感，仅作用10 min就几乎完全丧失絮凝。Flo型菌株在YNB、YEPD培养基中较在麦芽汁中絮凝水平高，而NewFlo型在YNB、麦芽汁中较在YEPD中絮凝水平高。上述结果表明，酵母NewFlo型和Flo型絮凝的生理生化性质有很大不同。NewFlo型菌株具备的一些特性能在发酵过程中根据需要更好的控制不同时90·12007V01．33No．I(Total229)期菌株的絮凝程度，为NewFlo型絮凝提供了更广阔、更优越的应用前景。3新絮凝特性应用前景絮凝是酵母很重要的特性之一，在工业发酵中，通常希望在发酵结束时，分散于发酵液中的细胞相互凝聚形成絮凝颗粒沉积，从而有利于细胞同发酵液的有效分离，可以大大简化后处理工艺，降低成本。如何控制絮凝基因只在发酵结束时表达，而不在发酵的早期及中期表达，这一问题已引起相关学者和发酵行业的重视。新絮凝基因是诱导型表达，只有在发酵后期糖浓度<0．3％时才能表达，这也正是发酵工业所需要的。作者所在实验室克隆得到新絮凝基因并在工业酵母中表达的研究结果将为酿造工业菌株的改良提供理论依据，同时也为酿造工业中亟待解决的重要难题提供了切实可行的途径，因而具有重要的理论意义和广泛的应用前景。同时新絮凝基因内部大量高度重复序列的变化会产生新的絮凝表型。不同的FLO基因和新絮凝基因组成的嵌合基因，其表现出来的絮凝表型也具有不同的特点，这也为筛选具有不同程度适于工业应用絮凝表型的酵母菌株提供了理论依据。随着对酵母新絮凝遗传调控及外界环境影响因素更深入的研究，新絮凝这一具有独特性质的生理现象必将显示出其巨大的应用价值。参考文献VerstrepenKJ，Derde“nCkXG，Versc山ertH．YeastnOCCLI—1ation． what brewers should know[川．ApplMicrobiOlBiotechn01，2003，61：197—205M山c01mStratford，StephenAssinder．Yeast noccula“On：F101 andNewFlO phenotypes and receptor 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文章来源：国际遗传学 网址: http://gjycx.400nongye.com/lunwen/itemid-16902.shtml

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